Lokalisasi Protein
Hai teman teman, blog hari ini akan membahas tentang bagaimana dan apa saja yang harus dilakukan untuk mengetahui lokalisasi dari sebuah protein sitoplasma menggunakan analisa western blotting.
Lokalisasi Protein
Lokasi dari sebuah protein di sitoplasma dapat dibedakan menjadi tiga golongan utama:
Protein bebas di dalam sitosol
Protein tertanam pada membran sebuah vesikel
Protein berada di dalam vesikel
Untuk mengetahui lokasi dari protein tersebut, umumnya digunakan bantuan dari dua agen kimiawi yang berperan penting dalam membedakan lokasi dari protein-protein tersebut. Agen tersebut adalah deterjen dan proteinase.
Proteinase
Kehadiran proteinase pada sebuah sampel seluler akan mendegradasi hampir semua molekul protein yang terekspos, e.g. protein sitosolik, etc. sehingga tidak akan terdeteksi ketika dilakukan pengamatan menggunakan teknik western blotting.
Deterjen
Berdasarkan sifat kimiawinya deterjen merupakan surfaktan, dengan kata lain, deterjen memiliki gugus polar dan nonpolar. Inkubasi sel dengan deterjen dapat melarutkan membran, yang kemudian mengekspos protein yang tertanam di membran ke lingkungan.
Sebagai contoh mari kita simak percobaan berikut.
Seorang peneliti ingin mengetahui lokasi dari tiga buah protein (A, B dan C) pada sebuah sel. Dalam percobaannya Ia menggunakan dua agen utama, Proteinase K dan X-100 (sebuah deterjen). Ia kemudian menginkubasi sampel pada beberapa kondisi sebagai berikut:
Prosedur 1: Sampel ditambahkan Proteinase K kemudian dipanaskan.
Prosedur 2: Sampel ditambahkan X-100 kemudian dipanaskan.
Prosedur 3: Sampel ditambahkan Proteinase K dan X-100, kemudian dipanaskan.
Prosedur 4: Sampel disentrifugasi pada kecepatan tinggi untuk mengisolasi vesikel dan mengeliminasi komponen sitoplasma.
Pada percobaan sebelumnya, peneliti tersebut telah mengetahui berat molekul dari ketiga protein:
A: 40 kDa
B: 50 kDa
C: 80 kDa
Hasil western blot yang didapatkan adalah sebagai berikut:
Untuk menentukan lokasi dari protein protein tersebut, kita harus terlebih dahulu mengetahui protein di mana saja yang akan muncul pada tiap prosedur.
Prosedur 1
Tanpa dilarutkanya membran vesikel menggunakan X-100, maka hanya protein sitosolik dan sebagian dari protein yang terletak pada membran vesikel yang akan terdegradasi. Protein di dalam vesikel akan terdeteksi utuh, protein di membran vesikel akan terdeteksi tidak utuh.
Prosedur 2
Tanpa adanya proteinase K dan dengan dilarutkanya membran vesikel, maka seluruh protein baik yang terdapat di sitosol, membran vesikel dan didalam vesikel akan terdeteksi utuh.
Prosedur 3
Kebalikan dari prosedur 2. Dengan tereksposnya seluruh protein dan adanya proteinase K, maka seluruh protein akan terdegradasi dan tidak akan ada satupun larik yang tampak pada hasil western blot.
Prosedur 4
Tanpa perlakuan dengan proteinase dan dengan melakukan sentrifugasi, maka hanya protein yang terdapat di dalam vesikel dan membran vesikel yang akan terdeteksi utuh.
Mari kita tentukan lokasi dari setiap protein satu persatu.
Protein A
Pada hasil western blot, protein A tidak ditemukan hanya pada prosedur 3. Dalam kata lain, protein A tidak pernah ditemukan ketika membran vesikel dilarutkan dan diberikan perlakuan dengan Proteinase K. Hal ini mengindikasikan bahwa protein A terlokalisasi didalam sebuah vesikel.
Protein B
Pada hasil western blot protein B hanya ditemukan pada prosedur 2. sehingga dapat disimpulkan protein B merupakan protein sitosolik.
Protein C
Protein C ditemukan utuh pada prosedur 2 dan 4 namun hanya sebagian pada prosedur 1. Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa protein C merupakan protein yang terletak di membran sebuah vesikel.
Soal-soal seperti ini umumnya muncul baik pada soal teori maupun soal praktikum, soal yang memerlukan baik konsep dasar dan penalaran.
Sekian materi untuk malam ini. Semoga bermanfaat.
-RC-
