PCR (Polymerase Chain Reaction), bukan pacar!
Polymerase Chain Reaction (PCR) ditemukan oleh Kary Mullis pada tahun 1983. PCR digunakan untuk mengamplifikasi (memperbanyak) segmen DNA. Teknik yang dapat digunakan untuk identifikasi dan analisis DNA ini adalah salah satu teknik andalan di bidang biologi molekuler karena relatif mudah dan murah.
Prosedur Teknik PCR
Terdapat 3 tahapan dalam setiap siklus PCR dan pengulangan terus menerus dari siklus ini membuat fragmen DNA identik bertambah secara eksponensial (2 à 4 à 8 à 16 dan seterusnya). 3 tahapan tersebut yaitu denaturasi (denaturation), penempelan (annealing) dan polimerisasi (polymerisation). Dalam melakukan 3 tahap ini, campuran reaksi untuk proses PCR harus mengandung dNTP (basa nukleotida dengan 3 gugus fosfat), sampel DNA, 2 jenis primer dalam jumlah yang banyak dan juga Taq polymerase.
Denaturasi (denaturation)
Seperti yang kita ketahui bahwa 2 untai DNA yang berkomplemen terhubung oleh ikatan hidrogen. 2 ikatan hidrogen antara basa A (adenin) dan T (timin) serta 3 ikatan hidrogen antara basa C (sitosin) dan G (guanin).
Denaturasi adalah proses pemisahan 2 untai DNA yang komplemen dengan merusak ikatan hidrogen diantara mereka. Denaturasi pada PCR dilakukan dengan cara memberi yang .
Di dalam sel, kita juga mengenal adanya proses perbanyakan kopi DNA yaitu proses replikasi DNA. Namun, pemisahan 2 untai DNA berbeda antara di dalam sel (in vivo) dengan PCR (in vitro). Pada sel, pemisahan untai DNA untuk tahap selanjutnya pada replikasi DNA dilakukan oleh enzim helikase, bukan denaturasi oleh temperatur tinggi.
2. Penempelan (annealing)
Setelah denaturasi, kini kedua untai DNA dapat DNA untuk proses lebih lanjut. Apa itu primer? Primer adalah sebuah untai DNA pendek yang diperlukan oleh DNA polimerase untuk memulai polimerisasi untai DNA yang komplemen.
Di dalam sel, primer disintesis oleh sebuah enzim bernama primase (seperti terlihat pada gambar di atas). Primer yang disintesis berupa sebuah untai pendek RNA.
Namun, pada PCR, primer berupa RNA melainkan sebuah yang sudah disediakan. Oleh karena itu, untuk melakkan PCR, kita harus mengetahui sekuens DNA yang mengapit fragmen DNA yang kita inginkan untuk mensintesis primer.
Seperti terlihat pada gambar, kita harus memiliki . 2 jenis primer ini dibutuhkan untuk mensintesis untai DNA baru yang komplemen pada (yang satu ke arah kiri, yang lainnya ke arah kanan). Kedua primer ini dibutuhkan agar kita dapat mengamplifikasi kedua untai DNA.
Kenapa harus menggunakan 2 primer? Jika kita hanya menggunakan satu jenis primer, hanya salah satu untai saja yang akan diamplifikasi. Jadi fail deh PCR nya L
Primer tersebut harus dapat menempel ke untai DNA yang ingin kita amplifikasi. Jadi kita harus menggunakan daripada temperatur denaturasi. Jika temperatur terlalu tinggi, ikatan hidrogen antara untai DNA dengan primer tidak dapat terbentuk.
3. Polimerisasi (polymerisation)
Setelah primer menempel, proses selanjutnya adalah polimerisasi DNA. Polimerisasi DNA dilakukan oleh . Namun pada PCR, kita tidak dapat menggunakan DNA polimerase biasa karena DNA polimerase adalah enzim dan enzim adalah protein. Sehingga, dapat terdenaturasi pada suhu tinggi. Oleh karena itu, kita harus menggunakan DNA polimerase dari organisme yang memang teradaptasi untuk hidup pada yang sangat tinggi. adalah polimerase yang sering digunakan pada PCR karena berasal dari organisme masih dapat berfungsi normal pada suhu tinggi.
Gambar di samping merupakan ringkasan tahapan PCR. Dari gambar, kita baru mendapatkan fragmen DNA yang kita inginkan setelah siklus ke-3. Hal ini karena sumber template meupakan sebuah kromosom.
DNA polimerase akan terus mempolimerisasi untai DNA jika memang masih terdapat template. Sehingga, jika template adalah seluruh kromosom, DNA polimerase juga akan mempolimerisasi sampai ujung dari kromosom tersebut.
Karena polimerisasi terjadi sampai ujung, pada 2 siklus pertama kita belum bisa mendapatkan hanya fragmen DNA yang kita inginkan. Salah satu atau kedua untai masih akan memiliki basa sampai ujung kromosom. Namun pada siklus ketiga, kita sudah mendapatkan 2 molekul yang hanya mengandung fragmen yang diinginkan. Untuk menghitung jumlah molekul yang diproduksi dari PCR menggunakan template seluruh kromosom, rumusnya adalah
Namun jika kita memiliki fragmen DNA yang kita inginkan saja, kita akan langsung mendapatkan fragmen DNA yang kita inginkan pada siklus 1. Sehingga rumus umumnya adalah ...
Seperti disebutkan sebelumnya, terdapat beberapa perbedaan antara replikasi DNA in vivo dengan replikasi DNA di PCR. Selain perbedaan-perbedaan tersebut, pada PCR juga tidak terdapat fragmen-fragmen Okazaki yang terbentuk pada replikasi DNA in vivo di lagging strand. Untuk mengetahui lebih lanjut mengenai replikasi DNA, baca Campbell Biology bab 16 ya.
Berbagai fungsi yang diperoleh dengan mengamplifikasi segmen DNA menggunakan PCR adalah analisis pelaku kejahatan, analisis penyakit genetik yang diwarisi oleh seseorang dan lain-lain.
Referensi:
Campbell, Neil A and Jane B Reece. Biology. 9th ed. San Francisco: Pearson, Benjamin Cummings, 2012. Print.
Mason, Kenneth A et al. Biology. 9th ed. New York N.Y.: McGraw-Hill, 2011. Print.
Freeman, Scott. Biological Science. San Francisco: Pearson/Benjamin Cummings, 2008. Print.
