RFLP dan Southern Blotting

Setelah teman-teman mempelajari tentang konsep elektroforesis (ada di blog “Cara Memaca Hasil Elektroforesis”), maka kita akan mempelajari aplikasi dari teknologi DNA rekombinan dari proses elektroforesis ini.

Seperti yang kita tahu, elektroforesis adalah prinsip pemisahan molekul, di mana kalau di bio, yang dipisahin itu umumnya, DNA, RNA, dan juga protein. Salah satu aplikasi yang sering digunakan untuk adalah analisis fragmen hasil elektroforesis. Gimana si proses ini dijalankan?

Jadi pertama-tama, untuk membuat fragmen DNA itu terlihat, maka tentu kita harus memotongnya terlebih dahulu. Sama seperti tali panjang (DNA utuh) yang harus dipotong-potong menjadi bagian yang lebih kecil (fragmen-fragmen DNA), lalu fragmen-fragmen itu dapat dipisahkan dengan elektroforesis berdasarkan ukurannya. Untungnya apa si analisis fragmen ini? Kalau misalnya temen-temen mau mengisolasi gen tertentu yang terletak di suatu fragmen tertentu, teman-teman bisa melakukannya dengan mengambil fragmen spesifik itu setelah dielektroforesis. Kalau DNA nya kecil kayak DNA bakteri dalam plasmid proses ini cukup mudah, tapi kalau DNA eukariot yang panjang-panjang (meskipun udah dipotong pun tetap panjang), entar jadinya fragmennya terlalu banyak jadi kayak smear.

Fragmen-fragmen ini berguna loh teman-teman. Yang paling penting adalah untuk membandingkan dua alel yang berbeda. Dua alel bisa jadi berbeda fragmen hasil restriksi karena perbedaan satu basa saja pada sisi pengenalan enzim restriksi bisa membuat DNA tidak berhasil dipotong. Nah, jadi perbedaan fragmen ini disebut juga RFLP (Restriction fragment length polymorphism). Tentu gak semua alel punya RFLP, tapi kalau seandainya suatu alel mengandung RFLP, pemotongan dengan enzim restriksi akan membuat campuran fragmen yang berbeda dari kedua alel tersebut.

Bingung? Bingung? Ayo liat contoh ini supaya lebih gampang ngertinya ya.

Suatu penyakit yang namanya sickle-cell (bentuk sel darah merah seperti bulan sabit) disebabkan karena perubahan struktur hemoglobin. Tapi kalau ditelusuri lebih dalam dari DNA-nya, ada perubahan sekuens pada situs pengenalan restriksinya di gen hemoglobin tersebut. Walaupun ada banyak teknik yang bisa digunakan untuk membedakan kedua alel (alel normal dan mutan), dulu melakukan RFLP pada gen hemoglobin dapat membedakan yang mana alel normal dan yang mana alel mutan.

Lihat gambar di bawah ini, dan cerna baik-baik, kita lihat pada alel normal, di pemotongan daerah di dekat gen hemoglobin atau di luar-luarnya ada 4 situs pemotongan, tapi gara-gara ada satu mutasi di sekuens pengenalan sisi restriksi pada gen beta globin, akibatnya tinggal ada 3 situs pemotongan.

Loh tapi kok di hasil elekroforesis yang alel mutan cuman ada dua fragmen, bukannya harusnya ada 3??? kan ada 3 situs pemotongan, setidaknya ada 3 dong?! Ya memang kalian benar, harusnya ada setidaknya 3. TAPI!! pada contoh ini, DNA telah dimurnikan jadi sampel kalian tuh murni banget, DAN ketika ada pemotongan yang hasil fragmennya sangat kecil, akibatnya adalah tidak terlihat di elektroforeis karena migrasinya cukup cepat.

Kasus yang dijelaskan di atas itu mungkin gampang ya, kalau kalian udah dikasih sampel isinya daerah gen hemoglobin aja. Coba kalau kalian dikasihnya DNA manusia, yang panjangnya 3 miliar basa, gimana caranya tuh melihat mana gen hemoglobinnya? Kita bisa memakai proses Southern Blotting.

Proses blotting didasarkan dari proses hibridisasi. Yaitu ada suatu penanda (probe) yang menempel khusus pada daerah gen hemoglobin, jadi cuman fragmen yang punya sebagian atau elemen dari gen hemoglobin inilah yang akan tertempeli oleh penanda ini. Penanda ini bisa berpendar karena ada fluoresensnya, karena DNA itu tidak berwarna, maka dengan memakai probe ini, hanya DNA spesifik saja yang terwarnai. Maka itu, kalau kita lihat dihasil elektroforesis setelah memakai probe, pita-pita DNA yang terwarnai itu adalah pita yang mengandung fragmen yang kita mau, pada kasus ini, gen hemoglobin.

Probe itu apa ya? Probe itu adalah bagian DNA single-strand yang berkomplementer dengan DNA yang kita inginkan. Misalnya ya, sekuens DNA gen hemoglobin itu 5’AAAAAA3’, maka nanti probenya 3’TTTTTTT5’. Loh, tapi kan DNA itu selalu dalam bentuk double helix, gimana caranya probe itu bisa nempel kalau dari awal sudah double helix. Jawabannya adalah pada proses Southern blotting, DNA yang dielektroforesis itu bakal dipisahin dulu (didenaturasi), supaya si probe bisa nempel sama dia. Nah ini adalah gambaran proses southern blotting. Check it out!

Anggaplah teman-teman mempunyai genome (keseluruhan DNA) dari teman kalian yang sehat (tidak menderita sickle cell), sehat tapi carrier, dan sakit sickle cell. Nah dari 3 miliar basa ini, teman-teman disuruh mengkonfirmasi sampel DNA mana yang homozigot dominan, heterozigot, sama yang homozigot resesif. Nah untuk melaksanakan RFLP, teman-teman menambahkan enzim restriksi, misalnya di sini itu DdeI. Hasil pemotongan dengan enzim akan menghasilkan banyak fragmen restriksi.

Setelah dipotong-potong, kita harus memisahkan DNA ini dengan cara elektroforesis. Nah kalau teman-teman liat, itu kan kayak banyak band-nya. tapi realita-nya, DNA itu tidak terlihat kecuali diwarnai, dan jauh lebih banyak band atau bahkan ada smear.

Lalu kita sudah siap untuk melaksanakan blotting. Blotting sendiri artinya transfer DNA. Jadi nanti gen nya itu dimasukan pada larutan basa dengan membran nitrocellulose. Membran nitrocellulose ini berlaku sebagai blot, di mana nanti larutan basa bakal disedot oleh gaya kapiler melewati gel dan akan memisahkan double helix DNA, lalu mentransfer DNA tadi ke nitrocelluose membrane. Jadi sekarang DNA itu kayak kejiplak di membran nitroselulosa. Setelah itu membran nitroselulosa akan kita campurkan pada suatu plastik yang berisi larutan yang mengandung probe penanda radioaktif spesifik gen hemoglobin ini. Meskipun demikian band itu belum terlihat.

Setelah ditunggu beberapa lama, sebuah film ditaruh di atas membran nitrocelullosa dengan DNA yang sudah menempel pada probe. Nah radioaktivitas itu akan meneybabkan film itu membentuk gambar yang sesuai dengan brekorespondensi dengan pita DNA dengan probe yang menempel padanya.

Beginilah proses southern Blotting. Namanya southern bukan berarti selatan ya, tapi yang nemuinnya namanya Southern. Gampang kan? Tapi kalau teman-teman masih bingung, bisa lihat video di youtube mengenai southern blotting.

Selamat belajar teman-teman. Masih ada beberapa teknik blotting yang lainnya.

Referensi: Campbell Biology, 9th Edition