Membaca Hasil Elektroforesis
Bagaimana Cara Membaca Hasil Elektroforesis?
Elektroforesis adalah teknik yang sangat umum digunakan untuk menganalisa senyawa seperti DNA. Inti dari elektroforesis adalah untuk memisahkan suatu senyawa berdasarkan ukurannya. Untuk lebih lengkapnya, teman-teman bisa membacanya di buku biologi umum seperti Campbell/Raven atau buku yang lebih dalam seperti Alberts.
Prinsip sederhana dari pemisahan DNA dengan elektroforesis itu seperti ini. DNA yang umumnya bermuatan negative akan tentu tertarik muatan positif. Kita nantinya akan menaruh DNA-DNA pada well (sumur) yang ada di ujung kutub negative. Nanti ketika diberikan aliran listrik, si DNA itu akan bermigrasi ke kutub positif. Nah terus mana prinsip pemisahannya?
Justru pemisahnnya oleh karena ukuran. Karena dinamakan gel, jd media DNA itu bergerak ada pada agar-agar yang berpori dalamnya. Anggap agar-agar itu sebagai jarring-jaring. Jika ada semut dan gajah, mana yang lebih mudah menembus jarring-jaring itu? Tentu semut kan. Nah jika ada dua sampel DNA dengan sampel yang satu banyak pasang basanya, sama yang satu sedikit pasang basanya, yang kecil ini lebih mudah untuk nimbus. Akibatnya, dalam waktu yang ditentukan (misal: 30 menit), si DNA yang lebih kecil udh menempuh jarak yang lebih jauh dari kutub negative menuju kutub positif itu. Paham Paham??
Sekarang, Ini adalah gambaran elektroforesis:
(Sumber: Genome Research Limited)
Sedangkan komponen pentingnya adalah:
Alatnya (tank): di alat ini bakal ada gelnya, tempat buat colok kabel-kabelnya, sama nanti tempat ini bakal keisi buffer.
Power supply: alat ini sebagai sumber pemberi listrik yang bakal ngatur berapa lama kita mau melakukan elektroforesis, sama voltase yang mau dipakai.
Gel: Gel ini bisa terbuat dari Agarose atau bahan lainnya. Agarose yang biasa dipakai bisa diatur besar-kecil porinya, dengan menentukan konsentrasi. Biasanya 1% tapi kalau makin kecil, maka resolusi pemisahannya semakin baik.
Buffer TAE: tersusun atas Tris, EDTA dan acetic acid. Makanya bau asem. Fungsi buffer ini untuk menjaga kondisi pH, serta karena ada ion-ionnya tentu memungkinkan adany aliran listrik. EDTA berfungsi untuk mengikat Ca2+ yang menjadi kofaktor bagi enzim nuclease. Jadi enzim nuclease jadi tidak aktif dan tidak berpotensi merusak sampel kita.
Loading Dye. Jadi sebelum kita masukin DNA kita di well, butuh suatu komponen yang namanya Loading Dye (LD). LD ini menngandung pemberat berupa senyawa yang memiliki massa jenis tinggi, supaya pas kita masukin DNA ke dalam sumur, DNAnya bisa tenggelam di sumur, gak ngapung ke mana-mana. Di LD juga ada pewarna. Yang perlu diperhatikan adalah, pewarna ini tidak menempel dan mewarnai DNA. Karena DNA gak berwarna, kita harus tau kapan mematikan alat elektroforesis kalo gak nanti udah kebablasan, makanya si LD memberika tanda warna biru yang menandakan dia udah gerak sampai mana. Sekali lagi, warna LD bukan warna DNA-nya.
Gel-Red. Nah, gel-red adalah senyawa interkalator DNA yang mengikat pada basa nitrogen DNA. Ketika diberi sinar UV di mesin illuminator, maka gel-red yang mengikat DNA ini bisa berpendar jadi warna merah. Gel-Red juga ditambahkan sebelum masukkin DNA ke well.
Proses Loading: Yang bentuk persegi panjang itu well (sumurnya)
Setelah dikasih penyinaran UV, nanti jadi berwarna. Loading Dyenya tidak berwarna tapi.
Untuk membaca hasil elektroforesis tentu tidak susah. Lihat illustrasi berikut:
Anggap ada DNA dengan ukuran 25 kb. A, B dan C menandakan situs pemotongan oleh sebuah enzim restriksi. Anggaplah enzim restriksi seperti gunting. Ketika pada well paling kiri diberikan enzim A+C, maka hasilnya akan terbentuk 4 fragmen. Begitu seterusnya. Mudah kan :)
Tentu soal OSN gak semudah ini, saya harap teman-teman bisa membaca lebih lanjut penerapan elektroforesis yang lebih kompleks lagi. Selamat belajar.
